PRUEBA DE FORMACIÓN DE PLACAS
Coger 20 ml de la linea celular 5C10.33 y pasarlos a un tubo de centrífuga; realimentar el cultivo original con 20 ml del medio fresco. Hacer lo mismo con la línea celular SP2/0.
De cada uno de los tubos de centrífuga sacar 500 ml a un ependorf; a partir de ellos se realizará el recuento de células:
Del ependorf de la línea 5C10.33 sacar 50 ml y pasarlos a otro tubo al que añadimos 50 ml de azul tripán (colorante que tiñe células muertas). Resuspender.
Hacer lo mismo con la línea SP2/0.
50 ml de células + 50 ml de azul tripán®dilución 1:1
Colocar un cubre sobre la parte superior de una placa Neubauer y añadir 10 ml de la dilución 1:1 (cultivo: azul tripán).
Teniendo en cuenta que las células viables aparecen refringentes, hacer un contaje de las células encerradas en 16 cuadriculas.
Realizar dos contajes en zonas diferentes.
nº de cél. viables/ml = nº cél. contadas x 104
LÍNEA 5C10.33 6+6/2 x 2 x 104 = 12x104 cél/ml.
LÍNEA SP2/0 6+12/2 x 2 x 104 = 18x104 cél/ml.
Por tanto en 20 ml de cultivo tenemos: 24x105 cél 5C10.33
36x105 cél SP2/0
El número óptimo de células por pocillo es de, aproximadamente, 5x104.
Centrifugar los 20 ml a 1200 rpm durante 10 mts y a temperatura ambiente.
Aspirar el sobrenadante con una pipeta pasteur. Resuspender el pelllet en medio de cultivo fresco añadiendo el volumen necesario para conseguir que haya 5x104 células por pocillo, si en cada pocillo añadimos 25 ml.
Línea celular 5C10.33 24x105 células 5x104 células
------------------- = -------------------
X 25 ml
X = 1200 ml de medio
Línea celular SP2/0 36x105 células 5x104 células
-------------------- = -------------------
X 25 ml
X = 1800 ml de medio
Resuspendiendo cada uno de los pellet en estas cantidades de medio conseguimos una cantidad óptima de células por pocillo.
* En la misma placa podemos hacer otra prueba poniendo 1x104 células por pocillo; para ello cogemos 200 ml de cada una de las suspensiones celulares y añadimos 800 ml de medio fresco. Así diluímos cinco veces la suspensión original obteniendo 1x104 células/25 ml.
Preparamos una solución de eritrocitos al 4% en GUB2+.
Preparamos una solución de suero de conejo 1:50 en GUB2+.
Preparamos una solución de suero de cobaya al 12.5% en GUB2+.
PROCEDIMIENTO
Añadir a cada pocillo: 25 ml de suspensión celular (según esquema).
25 ml de eritrocitos al 4%.
25 ml de suero conejo 1:50.
25 ml de suero cobaya al 12.5%.
Construir un control formado por todos los componentes excepto la suspensión celular.
DISEÑO DEL EXPERIMENTO
5x104 cél/pocillo 1x104 cél/pocillo
universidad de Oviedo
ncbi
